原子力システム研究開発事業及び原子力基礎基盤戦略研究イニシアティブ　成果報告会資料集

放射線発がんにおける非遺伝子変異的プロセスの解明

１．研究開発の背景とねらい

　本事業では放射線安全・放射線防護に資する知見を得るため、放射線発がんにおけるエピジェネティックな異常の関与を解明するために必要な実験研究を実施し、放射線発がんメカニズムについての最新の基礎的知見を得ることを目的とする。

１−１．研究の背景

　放射線はDNAを損傷するが、DNAには塩基配列という遺伝的（genetic）情報と、化学修飾によるエピジェネティック（epigenetic）な情報が含まれる。放射線によって重要な遺伝情報に突然変異が生じると、細胞増殖が無秩序に起こり、発がんにつながる。
　少量の放射線が人体の発がんにおよぼす影響は、中高線量での影響を単純な直線によって低線量域へ外挿することで推定されている。ところが現実の生体内には複雑な細胞間情報伝達や防御機構が存在するため、この単純な外挿は不正確であるという議論がある(例えば文献1)。この議論は培養細胞での観察に基づいているが、個体での証拠が不足している。
　生体内での細胞間の相互作用を伴う防御機構の一つに、組織の微小環境（microenvironment）の作用がある。たとえば、乳がん細胞を正常なラットの乳腺微小環境に移植すると、乳がん細胞は一見正常な乳腺組織を構築する（2,3）。ここでは正常な微小環境ががん化を抑制している。また、放射線照射した乳腺微小環境に完全にはがん化していない乳腺細胞を移植すると、移植された細胞ががん化する（4）。すなわち、正常微小環境はがん化に抑制的であるが、照射された微小環境はそうでない。これが真実であれば、個体内での放射線の複雑な作用を示す貴重な証拠であるが、そのような報告は少なく、機構も不明である。機構については、微小環境から及ぼされる作用が細胞の遺伝情報を変化させるとは考えにくいため、エピジェネティックな情報の変化を介していると推測される。

１−２．研究の目的

　本事業のねらいは、正常な微小環境ががん化抑制能力を有するかどうか、また放射線がそれを阻害するかどうかに関して、個体レベルの実験的証拠を蓄積することである。具体的には、がん細胞を非照射および放射線照射した個体の微小環境へ移植する実験を行い、移植細胞から発生する組織の形態（がんか否か）を観察して、微小環境の作用を検証する。またこの作用の機構を解明するため、エピジェネティックな情報の代表であるDNAメチル化に注目し、上記移植実験で形態の変化した組織のDNAを解析する。

２．研究開発成果

　平成２１年度は、移植実験系を立ち上げて実験を開始し、さらにDNAメチル化解析法の条件を決定した。

２−１．移植実験系の立ち上げおよび実験開始

　移植実験に使用可能な系統のラット（LEWおよびF344系統）を研究代表者の動物飼育施設に導入し、交配して、交雑ラット（（F344×LEW）F₁）を作出した。LEW系統雌ラットには発がん剤（1-メチル-1-ニトロソ尿素）処理を行い、移植に供する乳がんを作製した。一方、作出した（F344×LEW）F₁雌ラットには乳腺摘除手術を実施し、移植片を受入可能な乳腺微小環境を作製した。さらに、簡単な移植手術により手技的な問題を確認した。また、作製した乳がんからのがん細胞の調製法を決定した。
　以上の準備に基づき、３個の腫瘍を用いて19個体を対象に計２回の移植手術を実施した。適切な移植細胞数の検討のため、１接種部位当りの移植細胞数を変えて移植を実施し、移植後約90日に移植細胞が成長しているかどうかを調べて、最終的に5×10⁵細胞を移植することに決定した。がん細胞を移植した一部の個体において、移植部位からがんでない乳腺組織が発生した。

２−２．DNAメチル化解析法の条件検討

　ヒトおよびマウスで報告の多いChIP-on-Chip法（メチル化DNAを抗5-メチルシトシン抗体による免疫沈降で濃縮し、CpGアイランド配列を搭載したマイクロアレイで検出する方法）を採用した。まずDNA前処理および免疫沈降の条件を決定した。また網羅的メチル化解析を試行して、DNA試料の品質が解析に使用し得るものであることを確認した。さらに、同じ細胞から抽出したRNAをもとに発現マイクロアレイ解析を実施し、DNAメチル化に対応する遺伝子発現情報を獲得して、メチル化状態に伴って実際に遺伝子発現が変動する遺伝子（すなわちDNAメチル化によるエピジェネティックな制御を受ける遺伝子）の存在を確認した。以上より、DNAメチル化を伴うエピジェネティックな変化の解析条件を決定することができた。

３．今後の展望

　平成２１年度の目標は予定通りに達成できた。最終年次である平成２２年度は、がん細胞を非照射微小環境に移植する実験を継続し、発生する組織ががんの形態から正常に近い形態へ変化するかどうかを結論する。また放射線照射した微小環境内へがん細胞を移植し、移植部位に発生した組織の形態およびエピジェネティックな変化（DNAメチル化）を解析する。ただし、発生する組織の形態が変化しないと結論された場合は、得られた組織のDNAメチル化状態を解析することはせず、放射線によって誘発された腫瘍におけるエピジェネティックな異常を解析する。

４．参考文献

1. Tubiana (2005) Int J Radiat Oncol Biol Phys 63:317-319.
2. Maffini et al. (2004) J Cell Sci 117:1495-1502.
3. Maffini et al. (2005) Am J Pathol 167:1405-1410.
4. Barceloss-Hoff and Ravani (2000) Cancer Res 60:1254-1260.